shRNAつくりかた（暫定）

1. PubMedなどで標的mRNA配列をさがす

3. Design Hairpins for a Target Transcript Sequence (RNAi)をクリック

https://gyazo.com/67e38202daf41f95c6297d5378e03583

4. mRNA配列をコピペしてdesignをクリック

https://gyazo.com/08447812de88b6645b178ddaf237887d

5. こんな感じで一覧がでてくるのでスコアの高いものをいくつか選べばよい

Targetの場所(Start Pos.)はできるだけ別のものを選ぶ？

https://gyazo.com/27bd9b42f9a67bf13b80a37b216c03f3

＊Existing cloneはすでに使われているもの？っぽいのでここから選ぶと安全？

それ以外で不安ならTarget sequenceでBLASTをかけたほうがよいかも

6. OligoをクリックしてForward, Reverse sequenceを得る

CCGGGGAGTGAATAAGAACATATTTCTCGAGAAATATGTTCTTATTCACTCCTTTTTG

青で囲んだ部分がNotI断片、青字がPoly-U配列、黄色で囲んだ部分がEcoRI断片になっている。

7. このサイトだと末端がNotI-EcoRI断片になっているのでpSuper用であれば5’末端をBgl II、3’末端をHindIII断片にそれぞれ変える

例）

Fw : CCGGGGAGTGAATAAGAACATATTTCTCGAGAAATATGTTCTTATTCACTCCTTTTTG

↓

GATCTCCCGGAGTGAATAAGAACATATTTCTCGAGAAATATGTTCTTATTCACTCCTTTTTA

制限酵素断片配列の5’末端側CCCGGをGATCTCCCに、3’末端側GをAに変える

Re : AATTCAAAAAGGAGTGAATAAGAACATATTTCTCGAGAAATATGTTCTTATTCACTCC

↓

AGCTTAAAAAGGAGTGAATAAGAACATATTTCTCGAGAAATATGTTCTTATTCACTCCGGGA

相補鎖も同様に5’末端のAATTCをAGCTTに変え、3’末端側にGGGAをつける

https://gyazo.com/8b30498812ce588d6cd9287e84075033

(pSuper protocolより引用)

このProtocolではBgl IIサイトをつぶすためGATCのみ付け足している

あとはこのOligoを発注してLinker ligationしてpSuper-Stufferにいれればできるはず

補足: Hairpinカーブについて

GPP web protocolではCTCGAGとなっているが他にもいくつか配列候補があるみたい

1) TTCAAGAGA (Brummelkamp, T.R.et al. , 2002)

2) AAGTTCTCT (Promega)

3) TTTGTGTAG (Scherr, M. et al., 2003)

4) CTTCCTGTCA (Schwarz D. S. et al., 2003)

このうちざっと調べた感じだとBrummelkamp配列がメジャーっぽい？

要検討。

Fw : GATCTCCCGGAGTGAATAAGAACATATTTCTCGAGAAATATGTTCTTATTCACTCCTTTTTA

↓

GATCTCCCGGAGTGAATAAGAACATATTT TTCAAGAGA AAATATGTTCTTATTCACTCCTTTTTA

Re : AGCTTAAAAAGGAGTGAATAAGAACATATTTCTCGAGAAATATGTTCTTATTCACTCCGGGA

↓

AGCTTAAAAAGGAGTGAATAAGAACATATTTTCTCTTGAAAAATATGTTCTTATTCACTCCGGGA

\\raf\disk\CrkII\TV\PROTOCOL\web_page\Molecular_Biology.html

のKO/KDとかEnglish versionの How to make shRNAとかも参考に

shRNAつくりかた（暫定）