Preparation of Genomic DNA from OP-50
Aim
Injectionのcarrierとして使用するために、OP-50からgenomic DNAを抽出する
名市大の木村光太郎先生から、OP-50のgenomeを一緒にInjectionすると発現細胞がモザイクになりにくいと聞き、教えていただいたプロトコールを元にしている
Materials
OP-50
LB
TE buffer
10 % SDS
20 mg/mL proteinase K
chloroform
3M sodium acetate (pH 5.2)
isopropanol
70% Ethanol
10 mg/mL RNase
Methods
(Modified from Experimental Techniques in Bacterial Genetics, Jones and Bartlet, 1990)
OP-50を植菌した1.5 mL LB cultureを一晩培養する
エッペンチューブに移し、2分間遠心する
上清を捨て、467 uL TE bufferでペレットをピペッティングする
30 uL 10% SDS, 3 uL 20 mg/mL proteinase Kを加えて混ぜ、37℃で1時間インキュベートする
青チップで溶液がサラサラになるまでよくピペッティングする
等量のクロロホルムを加え、ボルテックスでよく混ぜる。2層が完璧に混ざって白くなるまで
12,000 rpmで10分間遠心
新しいチューブに上層(水層)を移す
等量のクロロホルムを加え、Step5-7を繰り返す
1/10 volume (50 uL) 3M sodium acetate (pH 5.2)を加えて混ぜる
6/10 volume (300 uL) isopropanolを加えてDNAが沈殿するまで、優しく混ぜる
(-30℃に10分ほど放置)
12,000 rpm、4℃で20分間遠心
上清を捨て、70% Ethanolでペレットを洗う
12,000 rpm、4℃で5分間遠心
上清を捨て、ペレットを5分ほど乾かす
少なくとも150 uL TE bufferでDNAを溶解する
1/100 (1.5 uL) 10 mg/mL RNaseを加え、37℃で1~2時間インキュベートする
電気泳動で>10 kbpのバンドを確認する
BioRaptor Sonication 30 sec x3
もう一度電気泳動を行い、DNAがFragment化しているか確認する (200-2 kbぐらい)
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL)でDNAを精製する
Remarks
Date :2021-02-02
Modified Date :
Author : e-ebine.icon