Neon NxT Electroporation Systemの使い方

https://youtu.be/OiQmJm_WR6s

Neon NxT Electroporation Systemを使って細胞に遺伝子導入する

Materials

cells

DNA

buffer R(<1900V) or buffer T(>1900V)

buffer E

Methods

チップの付け方（2:00~2:15)

ピペットをチップに押し込む（青い部分が閉じるまで）

上のボタンを強く押し込んでから引いてチップの金属芯と接続する

チップの外し方(5:29~5:35)

青いボタンを押してチップを外す（この段階では金属部分が接続したまま）

上のボタンを押して金属芯を外す

セッティング

本体の電源を入れる

パスワードを入力

チューブホルダーを安全キャビネットの中に入れる

チューブをセットしてE buffer 2 mLを入れる

実験手順

細胞の用意

当日までに細胞とDNA等を必要量（表を参照）用意する（1条件当たり1x10^5cell, DNA 0.5ug (接着細胞)が目安)

https://gyazo.com/7f39b93c165e870567195bcd9ef6f572

細胞をはがしてチューブに回収し遠心、上清を吸いPBSで再懸濁

細胞数を測定し必要量を別のチューブに移して遠心、上清を吸いbuffer R(<1900V)またはbuffer T(>1900V)で再懸濁(bufferの量は表を参照）

DNAと混ぜる

遠心している間にディッシュに培地を入れておく

エレクトロポレーション(4:40~5:30)

細胞懸濁液をピペットで吸い、ピペットをチューブにセットする

本体の画面を操作し、電圧、時間、回数を設定（細胞種によって最適条件は様々、初めて使う細胞の場合条件検討が必要）

画面右下のelectroporateのボタンを押す

緑のチェックマークが出たらピペットを外しディッシュに撒く

Remarks

細胞種ごとの最適条件

条件は細胞密度に依存する。自分たちで検討した条件は1x10^5 cells/10 uLでの条件。

RPE1-hTERT 1700V,20ms,1回　1400V,30ms,1回（村木、デモ時に条件検討）

MDCKII 1400V, 20ms, 1 pulse　1500V, 20ms, 1 pulse　1300V, 30ms, 1 pulse（北島条件検討2025/9/24）

A431 1400V, 30ms, 1 pulse 1200V, 40ms, 1 pusle (NGOCさん条件検討2025/9/31)

注意点

チップ内に気泡が入るとうまくいかないので注意する

ピペットをチューブにセットしたときに！の表示が出たらチップ内に空気が入っていることがあるので一度液を出して吸いなおすとうまくいくことが多い

電流を流した後にエラーが出た場合はその細胞は捨てる

チップは細胞種とDNAなどが一緒であれば3回まで使いまわせる

チューブは10回程度で新しいものに交換する

セレクションなどは翌日以降に行う

プラスミドは精製度が高く、エタノール沈殿していないものが望ましい