Maxiprep

*Englidh version follows the Japanese text.

Aim

大量のプラスミドDNAを抽出・精製する。

Materials

LB plate

LB液体培地

50 mLコニカルチューブ

NucleoBond Xtra Midi Plus kit (Macherey-Nagel, Cat. No. 740412.50)

Methods

目的のプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションしてLB plateに播種。翌日回収。

コロニーを多めに拾ってLB液体培地2 mLで振盪培養。2時間ほどで培地が濁ってくる。

羽根つきフラスコにLB液体培地を150 mL入れ、大腸菌入りの2 mLの培地を全量入れて一晩浸透培養。

これ以降は基本的にNucleoBond Xtra Midi Plusのプロトコルに従ってプラスミドDNAの抽出を行う。

大腸菌懸濁液を50 mLコニカルチューブ3本に分注して、4℃、6000 G、15分間遠心。

上清はフラスコに回収し、ハイターかオートクレーブで滅菌した後捨てる。

大腸菌ペレットにRES buffer 12 mL（チューブ3本で合計12 mL）を加え、vortexでしっかりペレットを崩した後、懸濁液を一本のコニカルチューブにまとめる。

RES bufferは4度保存。（+RNase）

LYS buffer 12 mLを入れて転倒混和し、5分静置（5分以上置かない）。※冬場はLys bufferを37℃で保存しておく。

NEU buffer 12 mLを入れてしっかり転倒混和する。

カラムにEQU buffer 25 mLを入れる。この時、カラムの淵に沿わせて回しいれる。

EQU bufferが落ちきったら、大腸菌溶解液を軽く転倒混和してからカラムに入れる。

大腸菌溶解液をカラムに入れる前に遠心（4℃、6000 G、15分間）し、上清のみ用いても良い。

溶解液が落ちきったら、EQU bufferを15 mLカラムに入れる。この時、カラムの淵に沿わせて回しいれる。

EQU bufferが落ちきったらカラム上部のフィルターを捨て、Wash buffer 25 mLを入れる。

Wash bufferが落ちきったら、カラムの下部に新しい50 mLコニカルチューブをセットし、カラムにELU buffer 15 mLを入れてDNAを溶出する。

DNA溶出液が落ちきったら、ここにイソプロパノール10.5 mLを加えてよくvortexする。4℃、15000 G、30分間遠心。

DNAのペレットを確認し、ペレットが落ちないようにイソプロパノールをゆっくり捨てる。

ペレットに70% EtOH 5 mLを加え、室温、15000 G、5分間遠心する。

70% EtOHをアスピレーターでできるだけ除去し、ペレットを室温で風乾する。

TRIS bufferを適量（300~600 uL）入れてしっかりvortexする。

DNA溶液を新しい1.5 mLチューブに移し、DNA濃度を測る。最終濃度が約1000 ng/uLになるようにTRIS bufferを追加する。このとき、毎回vortexして濃度を測り直す。計算した通りの濃度にはなりにくい。

Remarks

大腸菌は、ペレットの状態であれば－80℃で長期保存が可能。

ペレットにする前の懸濁液の状態で4℃で一日保存しても大丈夫。

20260430 三井加筆

DNA溶出液が落ちきったら、ここにイソプロパノール10.5 mLを加えてよくvortexする。

ここから先はNucleoBond® Xtra Midi Plusでやると早い。以下プロトコル。

30 mlシリンジからプランジャーを抜き取り、出口にNucleoBond Finalizerを取り付ける。

沈殿混液をシリンジの中にいれ、プランジャーを挿入してFinalizerに通す。

流出液は廃棄する。

30 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。

Finalizerをシリンジの出口に再びとりつける。

70%エタノール2 mlをシリンジの中にいれ、プランジャーを挿入してエタノールを押しこみ、Finalizerに通す。

流出したエタノールは廃棄する。

30 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。

Finalizerを再びシリンジの出口に取り付ける。

残ったエタノールを飛ばすため、プランジャーを挿入して空気を押しこみ、Finalizerに通す。

エタノールが全く出てこなくなるまで、このステップを3回以上繰り返す。

（キムタオル等の上で、Finalizerの先からエタノールが出てこないことを確認する。）

30 mlシリンジからFinalizerを取り外す。

1 mlシリンジからプランジャーを抜き取り、Finalizerをシリンジの出口に取り付ける。

適量のBuffer TRIS（またはTE Buffer）200～800 μlをシリンジの中に加える。

Finalizerの出口を新しい回収チューブにセットし、プランジャーを挿入してプラスミドを溶出する。

1 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。

Finalizerをシリンジの出口に再び取り付ける。

最初の溶出液をシリンジに戻し、同じ回収チューブの中に再び溶出する。

以下に画像付きでの説明あり。

Aim

To extract and purify large amounts of plasmid DNA.

Materials

LB agar plate

LB liquid medium

50 mL conical centrifuge tubes

NucleoBond Xtra Midi Plus kit (Macherey-Nagel, Cat. No. 740412.50)

Methods

Transform E. coli with the desired plasmid and plate on an LB agar plate. Incubate overnight.

Pick multiple colonies and inoculate into 2 mL of LB medium. Incubate for ~2 h until the culture becomes visibly turbid.

Inoculate the 2 mL culture into 150 mL of LB medium in a baffled flask and culture overnight at 37°C.

From this point, follow the manufacturer’s protocol (NucleoBond Xtra Midi Plus) with the following handling details:

Distribute the bacterial culture into three 50 mL conical tubes. Centrifuge at 6000 × g for 15 min at 4°C.

Collect the supernatant into a flask, sterilize with bleach or by autoclaving, and then discard.

Add 12 mL RES buffer total (12 mL total across the three tubes) to the pellets, vortex thoroughly, then combine into one tube.

RES buffer is stored at 4°C.

Add 12 mL LYS buffer, mix by gentle inversion, incubate for 5 min (do not exceed 5 min).

Store LYS buffer at 37°C in winter.

Add 12 mL NEU buffer and mix thoroughly by inversion.

Apply 25 mL EQU buffer to the column, running it down the inner edge of the column.

Once the EQU buffer has completely flowed through, gently invert the lysate to mix and load it onto the column.

Option: Before loading, centrifuge the lysate at 6000 × g for 15 min at 4°C and use only the supernatant.

After the lysate has flowed through, apply 15 mL EQU buffer to the column (again running it down the inner edge).

Once the EQU buffer has flowed through, discard the upper column filter and apply 25 mL Wash buffer.

After the wash has flowed through, place a new 50 mL conical tube under the column and elute DNA with 15 mL ELU buffer.

After elution is complete, add 10.5 mL isopropanol to the eluate and vortex well. Centrifuge at 15000 × g for 30 min at 4°C.

Confirm the DNA pellet, then discard isopropanol slowly without disturbing the pellet.

Add 5 mL of 70% ethanol to the pellet and centrifuge at 15000 × g for 5 min at room temperature.

Remove 70% ethanol as completely as possible using an aspirator, and air-dry the pellet at room temperature.

Add an appropriate volume of TRIS buffer (300–600 µL) and vortex thoroughly to resuspend.

Transfer the DNA solution to a new 1.5 mL tube and measure DNA concentration. Adjust with TRIS buffer to ~1000 ng/µL. Vortex and remeasure after each adjustment; the final concentration often deviates from the calculated value.

Addition by Mii (2026-04-30)

Once the DNA eluate has completely drained, add 10.5 mL of isopropanol and mix thoroughly by vortexing. Centrifuge at 4°C, 15,000 × g for 30 min.

From this point onward, the procedure can be performed more rapidly using the NucleoBond Xtra Midi Plus. The protocol is as follows:

Remove the plunger from a 30 mL syringe and attach a NucleoBond Finalizer to the outlet.

Load the precipitation mixture into the syringe, insert the plunger, and pass the solution through the Finalizer.

Discard the flow-through.

Remove the Finalizer from the 30 mL syringe and take out the plunger.

Reattach the Finalizer to the syringe outlet.

Add 2 mL of 70% ethanol into the syringe, insert the plunger, and push the ethanol through the Finalizer.

Discard the flow-through ethanol.

Remove the Finalizer and take out the plunger again.

Reattach the Finalizer to the syringe outlet.

To remove residual ethanol, insert the plunger and push air through the Finalizer.

Repeat this step at least three times until no ethanol is observed to come out.

(Confirm on a Kimwipe or similar that no ethanol is being expelled from the tip.)

Remove the Finalizer from the 30 mL syringe.

Remove the plunger from a 1 mL syringe and attach the Finalizer to the outlet.

Add an appropriate volume (200–800 µL) of Buffer TRIS (or TE buffer) into the syringe.

Place the outlet of the Finalizer into a new collection tube, insert the plunger, and elute the plasmid DNA.

Remove the Finalizer from the 1 mL syringe and take out the plunger.

Reattach the Finalizer to the syringe outlet.

Reload the first eluate into the syringe and pass it through the Finalizer again into the same collection tube.

See the link below for an explanation with images.

Remarks

Bacterial pellets can be stored long-term at −80°C.

Bacterial suspension before pelleting can be stored at 4°C for one day.