Maxiprep

*Englidh version follows the Japanese text.

Aim

大量のプラスミドDNAを抽出・精製する。

Materials

LB plate

LB液体培地

50 mLコニカルチューブ

NucleoBond Xtra Midi Plus kit (Macherey-Nagel, Cat. No. 740412.50)

Methods

目的のプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションしてLB plateに播種。翌日回収。

コロニーを多めに拾ってLB液体培地2 mLで浸透培養。2時間ほどで培地が濁ってくる。

羽根つきフラスコにLB液体培地を150 mL入れ、大腸菌入りの2 mLの培地を全量入れて一晩浸透培養。

これ以降は基本的にNucleoBond Xtra Midi Plusのプロトコルに従ってプラスミドDNAの抽出を行う。

大腸菌懸濁液を50 mLコニカルチューブ3本に分注して、4℃、6000 G、15分間遠心。

上清はフラスコに回収し、ハイターかオートクレーブで滅菌した後捨てる。

大腸菌ペレットにRES buffer 12 mL（チューブ3本で合計12 mL）を加え、voltexでしっかりペレットを崩した後、懸濁液を一本のコニカルチューブにまとめる。

LYS buffer 12 mLを入れて転倒混和し、5分静置（5分以上置かない）。※冬場はLys bufferを37℃で保存しておく。

NEU buffer 12 mLを入れて転倒混和し、4℃、1500 rpm、15分間遠心。

カラムにEQU buffer 25 mLを入れる。この時、カラムの淵に沿わせて回しいれる。

EQU bufferが落ちきったら、大腸菌溶解液の上清をカラムに入れる。カラムの淵に沿わせて回しいれる。

溶解液が落ちきったらカラム上部のフィルターを捨て、Wash buffer 25 mLを入れる。

Wash bufferが落ちきったら、カラムの下部に新しい50 mLコニカルチューブをセットし、カラムにELU buffer 15 mLを入れてDNAを溶出する。

DNA溶出液が落ちきったら、ここにイソプロパノール10.5 mLを加えてvoltexし、4℃、15000 G、30分間遠心する。

DNAのペレットを確認し、ペレットが落ちないようにイソプロパノールをゆっくり捨てる。

ペレットに70% EtOH 5 mLを加え、4℃、15000 G、10分間遠心する。

70% EtOHをゆっくり捨て、ペレットをP1000でとって1.5 mLチューブに回収する。

室温でペレットを15～30分間風乾する。

TRIS bufferを適量（300~600 uL）入れてしっかりvoltexする。

DNA濃度を測り、最終濃度が約1000 ng/uLになるようにTRIS bufferを追加する。このとき、毎回voltexして濃度を測り直す。計算した通りの濃度にはなりにくい。

Remarks

大腸菌は、ペレットの状態であれば－80℃で長期保存が可能。

ペレットにする前の懸濁液の状態で4℃で一日保存しても大丈夫。

Aim

To extract and purify large amounts of plasmid DNA.

Materials

LB agar plate

LB liquid medium

50 mL conical centrifuge tubes

NucleoBond Xtra Midi Plus kit (Macherey-Nagel, Cat. No. 740412.50)

Methods

Transform E. coli with the desired plasmid and plate on LB agar. Incubate overnight.

Pick multiple colonies and inoculate into 2 mL of LB medium. Incubate for ~2 h until the culture becomes visibly turbid.

Inoculate the 2 mL culture into 150 mL of LB medium in a baffled flask and culture overnight at 37°C.

From this point, follow the manufacturer’s protocol with the following handling details:

Distribute the bacterial culture evenly into three 50 mL conical tubes. Centrifuge at 6000 × g for 15 min at 4°C.

Collect supernatant into a flask, sterilize with bleach or autoclave, then discard.

Add 12 mL RES buffer total (split across 3 tubes) to the pellets, vortex thoroughly, then combine into one tube.

Add 12 mL LYS buffer, mix by gentle inversion, incubate for 5 min (no longer). Note: Store LYS buffer at 37°C in winter.

Add 12 mL NEU buffer, invert to mix, and centrifuge at 1500 rpm, 4°C, for 15 min.

Apply 25 mL EQU buffer to the column, running it down the inner edge.

Once the EQU buffer has flowed through, apply the supernatant from the lysed bacteria to the column in the same manner.

Discard the column filter, then apply 25 mL Wash buffer.

After it flows through, set a new 50 mL conical under the column and elute with 15 mL ELU buffer.

Add 10.5 mL isopropanol to the eluate, vortex, then centrifuge at 15000 × g, 4°C, for 30 min.

Discard isopropanol gently without disturbing the pellet.

Wash the pellet with 5 mL of 70% ethanol and centrifuge at 15000 × g, 4°C, for 10 min.

Discard ethanol carefully and transfer the pellet into a 1.5 mL tube using a P1000.

Air-dry at room temperature for 15–30 min.

Resuspend the pellet in 300–600 µL of TRIS buffer and vortex thoroughly.

Measure DNA concentration and adjust with TRIS buffer to around 1000 ng/µL, vortexing and remeasuring as needed.

Remarks

Bacterial pellets can be stored long-term at −80°C.

Bacterial suspension before pelleting can be stored at 4°C for one day.