Lipofection

Aim

Lipofection試薬を使って、発現チェックや安定発現細胞の作製のために細胞にプラスミドを導入する

Materials

培養細胞 (35mm dish / 6 well plate)

Lipofection試薬

Plasmids

Methods

1

table:Tube A

O-MEM 50 uL

DNA 1 ug

table:Tube B

O-MEM 50 uL

293fectin 1 uL

2 Tube Bを混ぜたら5分待つ

3 Tube AとTube Bを混ぜる。10-20分放置

4 細胞に加える

5 3時間後に培地交換

Aim

293fectinを使って、発現チェックや安定発現細胞の作製のために細胞にプラスミドを導入する

Material

培養細胞 (35 mm dish / 6 well plate)

下記の2種類の溶液

table:TubeA

O-MEM 50 uL

293fectin 1 uL

table:TubB

O-MEM 50 uL

目的のPlasmid DNA 1 ug 相当

Methods

1. Tube Aを作成する。293fectinを加え、室温で5分くらい待つ

2. Tube B にDNAを加える

3. ボルテックスで溶液A, Bを混ぜ、室温で15分程度待つ

4. 細胞に溶液を加える

5. 3時間後に培地交換（しなくても良い）

Remarks

Aim

293fectin reagent is a cationic, lipid based formulation for transfecting DNA into eukaryotic cells. This protocol is optimized for transfection of HeLa cells in a 35 mm dish.

Materials and Methods

293fectin Transfection Reagent (Invitrogen)

Opti-MEM I reduced serum medium (Invitrogen)

Cells in a 35 mm dish

Plasmid

Tube A: Add 1 μl 293fectin to 50 μl Opti-MEM I, mix, and incubate for 5 min at RT.

Tube B: Mix 1000 ng plasmid DNA and 50 μl Opti-MEM I.

Mix Tube A and Tube B and incubate for 10 to 20 min at RT, to allow DNA 293fectin complexes to form.

Add the mixture dropwise to the cells and mix gently by rocking the dish back and forth.

Incubate the cells for 24 to 48 hours.

Remarks

Do not add 293fectin directly to the walls of the tube.

Make sure the plasmid DNA is clean. Contaminants may kill the cells.

1

table:Tube A

10 cm dish 6 well

O-MEM 　　　1476 　ul 250 uL

DNA 　　　24 　ug 4 ug

table:Tube B

O-MEM 1440 ul 250 uL

PEImax (1 mg/mL) 60 ul 10 uL

2 Tube Bを混ぜたら5分待つ

3 Tube AとTube Bを混ぜる。20分放置

（この間に培地を温めておき、培地交換する。）

4 細胞に加える

5 3時間後に培地交換

1

table: Tube A

O-MEM 100 uL

DNA 1.5 ug

2 Tube Aにpolyfectを10 uL加える

3 Vortex, 5分放置

4 細胞に加える（正式なプロトコルではチューブに培地を500 uL足してそれを細胞に加える）

1

table:Tube A

O-MEM 100 ul

DNA 2 ug

2 Tube AにFugene HDを3-8ul 加える

FugeneHDが直接チューブに付かないようにする

3 1秒Vortexして5分放置

4 15分放置

5 細胞に加える

6 3時間後に培地交換

（培地交換しなくてよいとプロトコルでは）

1

table: Tube A

O-MEM 125 uL

LF3K reagent 5 uL (3.75 - 7.5 uL)

2

table:Tube B

O-MEM 125 uL

DNA 2.5 ug

P3K reagent 5 uL

*P3K reagentは、DNAを入れた後に添加する。

3 Tube AとBを混ぜる。10-15分放置

4 細胞に加える

5 3時間後に培地交換

（培地交換しなくてよいとプロトコルには書いてあるけど、したほうがよい。）

1

table:Tube A

O-MEM 100 uL

DNA 1 ug

TransIT-LT 3 uL

2 Tube Aを混ぜたら15-30分待つ

3 細胞に加える

4 3時間後に培地交換

1. Tube AにBuffer Yellowを 90 uL, DNAを 1 ug 加えて混ぜる

2. Tube BにViromer Yellow溶液を0.4 uL加え、Buffer Yellowを 10 uLそこに添加しすぐに混ぜる。逆の順番はダメ。

3. Tube A 90 uL を Tube Bに加える。Total 約 100 uL。

4. 15分放置

5. 細胞に加える

6. 3時間後に培地交換

siRNA, ssODNのトランスフェクションに使用する

24 well

1

table:Tube A

O-MEM 50 uL

10 uM siRNA or ssODN 1 uL

2

table:Tube B

O-MEM 50 uL

RNAiMax 3 uL

3 Tube Bを混ぜたら5分待つ

4 Tube AとTube Bを混ぜる。10-20分放置

5 細胞に加える

6 3時間後に培地交換

6 well plate, 1 mL medium, 50-70% confluency

1. Thoroughly vortex Xfect Polymer.

2. In a 1.5 mL tube, dilute 5 µg of your plasmid DNA with Xfect Reaction Buffer to a final volume of 100 µl. Mix well by vortexing for 5 sec at high speed.

3. Add 1.5 μl Xfect Polymer to the diluted plasmid DNA. Mix well by vortexing for 10 sec at high speed

4. Incubate for 10 min at R.T.

5. Spin down

6. Add the entire 100 μl of nanoparticle complex solution dropwise to the cell culture medium. Rock the plate gently back and forth to mix.

7. Incubate the plate at 37°C for 4 hr to overnight

8. Change medium to 2 mL fresh one.

Remarks

HeLa italy: 293fectin (best), PEImax (not so bad), LF2K (bad, all cells die)

HeLa tohoku: 293fectin (best)

HeLa RIKEN: LF3K (best), LF2K (not so bad), 293fectin (not so bad)

Lenti-X 293T: PEImax (best, cheap), LF2K (good, expensive)

MDCK RIKEN: Amaxa electropolation (best, T-023), LF3K (so so)

HT-1080: LF2K (best, so so), 293fectin (so so)

Cos7: Polyfect (good for imaging, cheap),

Cos7 RIKEN: 293fectin (best, 30-40% efficiency), TransIT-LT (not so bad, 20-30%), PEImax (not so bad, 20-30%), Polyfect (not so bad, 20%), LF3K (60-70 % efficiency, toxic), LF2K (toxic)

MCF10A: VIROMER RED (better), LF3000 (not so good)

RPE-1: 293fectin (best, so so), LF2K (toxic), LF3K (toxic), Fugene (bad), PEImax (bad)

NIH-3T3: Amaxa electropolation (T-023 is the best, U-030 and A-024 are so so), LF3K (so so)

Lipofection (copy)