Lipofection
Aim
Lipofection試薬を使って、発現チェックや安定発現細胞の作製のために細胞にプラスミドを導入する
Materials
培養細胞 (35mm dish / 6 well plate)
Lipofection試薬
Plasmids
Methods
1
table:Tube A
O-MEM 50 uL
DNA 1 ug
table:Tube B
O-MEM 50 uL
293fectin 1 uL
2 Tube Bを混ぜたら5分待つ
3 Tube AとTube Bを混ぜる。10-20分放置
4 細胞に加える
5 3時間後に培地交換
1
table:Tube A
10 cm dish 6 well
O-MEM 1476 ul 250 uL
DNA 24 ug 4 ug
table:Tube B
O-MEM 1440 ul 250 uL
PEImax (1 mg/mL) 60 ul 10 uL
2 Tube Bを混ぜたら5分待つ
3 Tube AとTube Bを混ぜる。20分放置
(この間に培地を温めておき、培地交換する。)
4 細胞に加える
5 3時間後に培地交換
1
table: Tube A
O-MEM 100 uL
DNA 1.5 ug
2 Tube Aにpolyfectを10 uL加える
3 Vortex, 5分放置
4 細胞に加える(正式なプロトコルではチューブに培地を500 uL足してそれを細胞に加える)
1
table:Tube A
O-MEM 100 ul
DNA 2 ug
2 Tube AにFugene HDを3-8ul 加える
FugeneHDが直接チューブに付かないようにする
3 1秒Vortexして5分放置
4 15分放置
5 細胞に加える
6 3時間後に培地交換
(培地交換しなくてよいとプロトコルでは)
1
table: Tube A
O-MEM 125 uL
LF3K reagent 5 uL (3.75 - 7.5 uL)
2
table:Tube B
O-MEM 125 uL
DNA 2.5 ug
P3K reagent 5 uL
*P3K reagentは、DNAを入れた後に添加する。
3 Tube AとBを混ぜる。10-15分放置
4 細胞に加える
5 3時間後に培地交換
(培地交換しなくてよいとプロトコルには書いてあるけど、したほうがよい。)
1
table:Tube A
O-MEM 100 uL
DNA 1 ug
TransIT-LT 3 uL
2 Tube Aを混ぜたら15-30分待つ
3 細胞に加える
4 3時間後に培地交換
1. Tube AにBuffer Yellowを 90 uL, DNAを 1 ug 加えて混ぜる
2. Tube BにViromer Yellow溶液を0.4 uL加え、Buffer Yellowを 10 uLそこに添加しすぐに混ぜる。逆の順番はダメ。
3. Tube A 90 uL を Tube Bに加える。Total 約 100 uL。
4. 15分放置
5. 細胞に加える
6. 3時間後に培地交換
siRNA, ssODNのトランスフェクションに使用する
24 well
1
table:Tube A
O-MEM 50 uL
10 uM siRNA or ssODN 1 uL
2
table:Tube B
O-MEM 50 uL
RNAiMax 3 uL
3 Tube Bを混ぜたら5分待つ
4 Tube AとTube Bを混ぜる。10-20分放置
5 細胞に加える
6 3時間後に培地交換
Remarks
HeLa italy: 293fectin (best), PEImax (not so bad), LF2K (bad, all cells die)
HeLa tohoku: 293fectin (best)
HeLa RIKEN: LF3K (best), LF2K (not so bad), 293fectin (not so bad)
Lenti-X 293T: PEImax (best, cheap), LF2K (good, expensive)
MDCK RIKEN: Amaxa electropolation (best, T-023), LF3K (so so)
HT-1080: LF2K (best, so so), 293fectin (so so)
Cos7: Polyfect (good for imaging, cheap),
Cos7 RIKEN: 293fectin (best, 30-40% efficiency), TransIT-LT (not so bad, 20-30%), PEImax (not so bad, 20-30%), Polyfect (not so bad, 20%), LF3K (60-70 % efficiency, toxic), LF2K (toxic)
MCF10A: VIROMER RED (better), LF3000 (not so good)
RPE-1: 293fectin (best, so so), LF2K (toxic), LF3K (toxic), Fugene (bad), PEImax (bad)
NIH-3T3: Amaxa electropolation (T-023 is the best, U-030 and A-024 are so so), LF3K (so so)
Date :2018-5-22
Modified Date :2022-03-02 aoki
Author :e-ebine.icon
Lipofection (copy)