Lenti virusの作製
Aim
レンチウイルスを作製する。
Materials
Lenti-X 293T細胞 (35mm)
下記の2種類の溶液
table:TubeA
O-MEM 250 uL
PEIMAX (1 mg/mL) 10 uL
table:TubeB
O-MEM 250 uL
psPAX2 1 ug
pCMV-VSVG-REG or pE-Eco 1 ug 相当
目的のPlasmid DNA 2 ug 相当
Methods
1. Tube Aを作成する
2. PEIMAXを加え、室温で5分くらい待つ
3. Tube B にDNAを加える
4. ボルテックスで溶液A, Bを混ぜ、室温で15分程度待つ
5. 細胞に溶液を加える
6. 3~6時間後に培地交換
Remarks
LF2000のプロトコルに準拠しているっぽい。
感染させたい細胞によってVSVGとEcoを使い分ける。大体はVSVGでいけるイメージ。
ao.icon
VSVGは水泡性口内炎ウイルスVSVのエンベローブ(VSV-G)を使っている。これは、細胞膜上のフォスファチジルセリンを認識してウイルスが感染するため、ほぼすべての細胞に感染させることができる(pantropic)。従って、実験者が感染しないように手袋(とできれば白衣)をつけて実験すること。なお、VSV-Gは細胞種によっては毒性が出る。またVSV-Gをエンベローブにもつレトロ、レンチウイルスは-80度で保存可能だが、感染価が下がる。
Ecoエンベロープはげっ歯類のEcoVR受容体に結合する。したがってヒトには感染しない(ecotropic)。ウイルス感染実験の安全を期す場合には(例えば癌遺伝子を導入する場合など)、まずEcoVRを発現させてから、次にecoエンベロープをもつウイルスを感染させることで安全に感染実験を行うことができる。