Fission yeast tagging and deletion

Aim

分裂酵母の内在性遺伝子のC末端に蛍光タンパク質などをタグ付けした株の作製方法 Methods for Creating Fission Yeast Strains with Fluorescent Protein Tags at the C-terminus of Endogenous Genes

分裂酵母の内在性遺伝子を破壊した株の作製方法 Methods for Creating Fission Yeast Strains with Disrupted Endogenous Genes

Materials

PCR

PCR polymerase (KOD one)

fission yeast genome DNA

Primers

Transformation

YEA liquid medium (or SD)

1xLiOAc/TE 30%w/v Glycerol

50%w/v PEG4000 in 1xLiOAc/TE

carrier DNA

YEA plate (or SD plate)

Selection

Replica tool

Methods

PCR

Design of Primers

右上の検索から目的遺伝子を検索。

左の「Sequence and transcripts」から「Sequence」を選択。「Show nucleotide sequence」にチェック。

5'UTR, Exons, Introns, 3'UTRのすべてにチェックを入れる。「~base upstream of translation start」と、「~base downstream of translation end」を両方1000 bpにする。

「Download sequence」から「Genome Region as GenBank」を選択

Banchlingで.gbファイルをインポートすると、アノテーションがついている。

2. タグ付けの場合、遺伝子名+tagF1, F2, R2, R1, checkF, Rの4つのPrimerを設計する。（e.g. cdc2-tagF1）

目的遺伝子の終始コドンを見つける。

終始コドンより上流に500 bpぐらいのところにtagF1を設計する。tagF1のすぐ上流にcheckFを設計する。どちらも、20 base以上、Tm 55℃以上、GC 60%以下、3'末端がG or Cが望ましい。

終始コドンより下流に500 bpぐらいのところにtagR1を設計する。tagR1のすぐ下流にcheckRを設計する。どちらも、20 base以上、Tm 55℃以上、GC 60%以下、3'末端がG or Cが望ましい。

終始コドン直前からReverse方向にtagF2を設計する。20 base以上、Tm 55℃以上、GC 60%以下、3'末端がG or Cが望ましいが、難しいことが多い。tagF2の5'末端に以下の配列を付与する。「5'-TTAATTAACCCGGGGATCCG -3'」

終始コドン直後からForward方向にtagR2を設計する。20 base以上、Tm 55℃以上、GC 60%以下、3'末端がG or Cが望ましいが、難しいことが多い。tagF2と違って、5'の位置を多少ずらすことができるが、隣の遺伝子との位置関係に注意。tagR2の5'末端に以下の配列を付与する。「5'-GTTTAAACGAGCTCGAATTC -3'」

KOの場合は、F1/F2をStart codonの直前に配置する。

https://gyazo.com/09038d551592b855a61e53db8ed2de22

1st PCR

tagF1/F2のペアと、tagR1/R2のペアで1st PCRをかける。

table: 1st PCR mixture

Template genomic DNA 0.5 μL

Primer1 (tagF1 or tag R1) 0.5 μL

Primer2 (tagF2 or tag R2) 0.5 uL

Milli Q 8.5 μL

KOD One 10 μL

Total 20 μL

table: 1st PCR protocol

98℃ 1 min

98℃ 5 sec

55℃ 5 sec x 30 cycles

68℃ 5 sec

68℃ 1 min

4℃ Keep

電気泳動でチェック、精製（15 μLで溶出）

-20℃で保管可能

2nd PCR

2nd PCRのtemplateには、pFA6a-GFP-kanMX6などを使う。

オリゴ設計の時にF2とR2にくっつけた配列の相同配列を持っている。

table: 2nd PCR mixture

Template plasmid 0.5 μL

Primer1 (tagF1) 0.5 μL

Primer2 (tagR1) 0.5 uL

1st PCR product F 1 μL

1st PCR product R 1 μL

Milli Q 21.5 μL

KOD One 25 μL

Total 50 μL

table: 2nd PCR protocol

98℃ 1 min

98℃ 5 sec

55℃ 5 sec x 25 cycles

68℃ 5 sec

68℃ 1 min

4℃ Keep

5 μLを泳動して確認

残りをエタノール沈殿 or カラム精製で精製。

-30℃で保存可能

Transformation

Fresh cells are inoculated into liquid medium.

Cell is cultured with 5 ml SD media in the flask at 32℃ (if cell is ts, 25℃ incubation should be better).

YEAでも問題ないです。

culture to 1.0x10^7cells/ml

Cells are collected to a 15 ml tube by 3000rpm and transfer to 1.5 mL tube.

Cell pellet is suspend into 50 μL 1xLiOAC/TE Glycerol.

add 5ul a carrier DNA (10 mg/mL) and 5 μL prurified 2nd PCR product. Vortex well.

add 145 μL 50% PEG in 1xLiOAc/TE, vortex well.

incubate at 42℃ for 10 min.

3000rpm for 1min and remove the sup.

pellet was re-suspend with media or water.

cell suspension is spread onto the plate. Antibiotic-free YEA plate should be used here.

Selection

For antibiotic selection, cells are replicated to antibiotics containing plate one day after transformation.

2-3 days are sufficient for seletion at 32℃. Colonies will appear.

Pick up colonies and streak them onto new antibiotics-containg YEA plate.

Check the phenotypes and the genotype.

Colony PCR is recommended.

table: colony PCR mixture

Primer1 (TtefF) 0.5 μL

Primer1 (checkF) 0.5 μL

Primer2 (checkR) 0.5 uL

Milli Q 3.5 μL

KOD One 5 μL

Total 10 μL

After dispense the solution into PCR tubes, only a little amount of cells are picked by plastic tips and suspended.

table: colony PCR protocol

98℃ 1 min

98℃ 10 sec

55℃ 5 sec x 40 cycles

68℃ 10 sec

68℃ 1 min

4℃ Keep

You can get 700~ bp band for positive clone while You can see 1000~bp band.

Negative conrtrol (generally parental strain) must be included. Positive control if possible.

Remarks