Colony PCR

Aim

大腸菌が目的のプラスミドを持っているかを調べる。

Materials

1 コロニー分 (premix)：

Taq DNA Polymerase 0.05 ul

dNTP 1 ul

10x Standard Taq buffer 1 ul

Primer-F 0.2 ul

Primer-R 0.2 ul

DDW 7.55 ul

16 コロニー分 (premix)：

Taq DNA Polymerase 0.8 ul

dNTP 16 ul

10x Standard Taq buffer 16 ul

Primer-F 3.2 ul

Primer-R 3.2 ul

DDW 120.8 ul

24 コロニー分 (premix)：

Taq DNA Polymerase 1.2 ul

dNTP 24 ul

10x Standard Taq buffer 24 ul

Primer-F 4.8 ul

Primer-R 4.8 ul

DDW 181.2 ul

Methods

1. PCRで確認したコロニーの大腸菌を増やすために新しく大腸菌プレートを解凍して準備する。

2. 拾ってくるコロニーの分だけ上記のpremixを作製し、8連チューブに10 ulずつ分注する。

3. チップでコロニーを1つ取ってきて、新しい大腸菌プレートに横に線を引くようにまき、その後PCRチューブに入れる。

爪楊枝にはPCRを阻害する成分が含まれているため使用したらダメ

4. PCR

1 95℃ 30 s

2a 95℃ 30 s

2b 55℃ 1 min x35 cycles

2c 68℃ 2 min

3 68℃ 1 min

4 15℃ Infinite

Remarks

10x Standard Taq bufferとdNTP、Taq DNA Polymeraseは制限酵素などが入っている冷凍庫にある

10x Standard Taq bufferとdNTPは50℃で解凍

*右上のアイコンからDuplicate this pageを選び、Duplicate pageにProtocolを記す（Templateに上書きしないように）