Colony PCR
Aim
大腸菌が目的のプラスミドを持っているかを調べる。
Materials
1 コロニー分 (premix):
Taq DNA Polymerase 0.05 ul
dNTP 1 ul
10x Standard Taq buffer 1 ul
Primer-F 0.2 ul
Primer-R 0.2 ul
DDW 7.55 ul
16 コロニー分 (premix):
Taq DNA Polymerase 0.8 ul
dNTP 16 ul
10x Standard Taq buffer 16 ul
Primer-F 3.2 ul
Primer-R 3.2 ul
DDW 120.8 ul
24 コロニー分 (premix):
Taq DNA Polymerase 1.2 ul
dNTP 24 ul
10x Standard Taq buffer 24 ul
Primer-F 4.8 ul
Primer-R 4.8 ul
DDW 181.2 ul
Methods
1. PCRで確認したコロニーの大腸菌を増やすために新しく大腸菌プレートを解凍して準備する。
2. 拾ってくるコロニーの分だけ上記のpremixを作製し、8連チューブに10 ulずつ分注する。
3. チップでコロニーを1つ取ってきて、新しい大腸菌プレートに横に線を引くようにまき、その後PCRチューブに入れる。
爪楊枝にはPCRを阻害する成分が含まれているため使用したらダメ
4. PCR
1 95℃ 30 s
2a 95℃ 30 s
2b 55℃ 1 min x35 cycles
2c 68℃ 2 min
3 68℃ 1 min
4 15℃ Infinite
Remarks
10x Standard Taq bufferとdNTP、Taq DNA Polymeraseは制限酵素などが入っている冷凍庫にある
10x Standard Taq bufferとdNTPは50℃で解凍
Date :2025/3/11
Modified Date :
Author :S-Nakashima.icon
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