CRISPR/Cas9を用いたノックイン
ガイドRNAの設計
例：Human AAVS1 lociにノックインする場合
Human AAVS1(PPP1R12C)の配列とってくる
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000019.10?report=fasta&from=55090918&to=55117637&strand=true
benchlingに配列貼りつける
切れる位置を確認
https://www.researchgate.net/figure/Detailed-design-of-PITCh-TG-in-human-AAVS1-locus-Black-lines-indicate-the-target_fig1_316574925
TCCACCCCACAGTGGGGCCA/CTAGGGACA….
/の位置で切れる
切れる周辺の領域を50 bpくらい適当に選択
benchling右側のサイドバーの”CRISPR”ボタンを押す
“Design and analyze guides”
”Single guide”, Guide Length = 20, Genome = hg18, Homo sapiens, PAM = NGG
Target region の右の＋ボタンをクリック
＞Off-Target Scoreの順に並べて、適切な配列を選択　PAMの配列とその前の配列で判断
＞Assemble
https://benchling.com/s/seq-Sw3F4ENgUMZ5HIzCOgRS?m=slm-NYCjLIAoeVEcFD5Pd7wQ
PCRで導入したい遺伝子の両端にAAVS1のマイクロホモロジー配列を入れる
20 bpのマイクロホモロジー配列をPCRによりLandingpadの両端につけるためのプライマーを設計
参照した論文
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/21655979.2017.1313645
AAVS1のsgRNA targetの前後の20 bpを使用
例）Landing padの導入
https://benchling.com/s/seq-Zgu7TmCp6uhif2n6KZt4?m=slm-C2PNzV02JQ109HlXdUCr
Landingpad MH Left TCCACCCCACAGTGGGGCCAggcttatgcgatgaggccctttcgtcttcac DNA
Landingpad MH Right GTCACCAATCCTGTCCCTAGttacccggggagcatgtcaaggtcaaaatc DNA
100 ulスケールでPCRかけて、15 ul NEでゲル抽出して使用
設計したガイドRNA＋Cas9、目的遺伝子＋マイクロホモロジーのベクターをリポフェクションで共導入