分裂酵母胞子パーコール密度勾配遠心精製
Aim
vegitative cell やゴミなどを除いて、胞子だけキレイにとってくる
Materials
SPA plate
Glusurase
0.5% Triton-X100
Percoll
Methods
SPAプレート1枚
2% Glusrase 500 ul, x3, 1000 uL x3, 30 deg for 1 h
ボリュームは適宜調整
Wash spores with 0.5% Triton-X100 three times
Suspended into 2 mL 0.5% Triton-X100
ボリュームは適宜調整
Percoll layer as follows (total 800 uL mixture for 1.5 mL tube, 1600 uL mixture for 2 mL tube)
(1) 80% Percoll (160 ul Percoll, 20 ul 0.5% Triton-X, 20 ul 2.5 M sucrose)
(2) 70% Percoll (140 ul Percoll, 40 ul 0.5% Triton-X, 20 ul 2.5 M sucrose)
(3) 60% Percoll (120 ul percoll, 60 ul 0.5% Triton-X, 20 ul 2.5 M sucrose)
(4) 50% Percoll (100 ul Percoll, 80 ul 0.5% Triton-X, 20 ul 2.5 M sucrose)
30 uL spore suspention is layerd.
30, 60, 90,120, 240 all OK. Less than 90 seem to be better for 800 uL percol gradient.
10,000 rpm 4 deg 1h (30 min centrifugation is sufficient. or less?)
collect each layer
most lower pellet is concentrated spore. More high-density Percoll (90%) is required ??
Repeated Percoll gradient centrifugation might be better.
spore layer is washed with 0.5% Triton-X100 for three times and suspended into Triton-X for store at 4 deg.
酒井簡便法 (2021/05/17)
SPAプレートで26℃で培養 (2~4日程度)
プレート上の細胞を回収しDDWで懸濁
プレートにDDWを滴下すると無駄なく回収できる
2% グルスラーゼを添加し、30℃ or RTで2~4 hr程度反応
Vegetative cellsをある程度除けるまで反応させる
遠心して細胞を回収 (3000 rpm, 1 min, RT)
0.5% Triton-X100 で3回洗浄
0.5% Triton-X100 1 ml程度で懸濁
パーコール密度勾配遠心 (10000 rpm, 5 min, RT)を2回行う
80%パーコール溶液 (800 ul Percoll, 100 ul 0.5% Triton-X, 100 ul 2.5 M sucrose) 1 mlに細胞懸濁液 200 ulをロード
0.5% Triton-X100 で3回洗浄
0.5% Triton-X100 適量で懸濁 (200 ul程度)
4℃で保存
酒井簡便法2 (2022/03/15)
グルスラーゼ処理までは同じ
遠心して細胞を回収 (3000 rpm, 1 min, RT)
0.5% Triton-X100 で2回洗浄
0.5% Triton-X100 1 ml程度で懸濁
パーコール密度勾配遠心 (10000 rpm, 5 min, RT)を2回行う
80%パーコール溶液 (800 ul Percoll, 200 ul 0.5% Triton-X) 1 mlに細胞懸濁液 200 ulをロード
0.5% Triton-X100 で2回洗浄
0.5% Triton-X100 適量で懸濁 (200 ul程度)
4℃で保存
Remarks
ref. A Screen for Germination Mutants in Saccharomyces cerevisiae (2011, G3)
Date : 20200523
Modified Date :
Author : y-goto.icon